UJIAN AKHIR SEMESTER
MATA
KULIAH : KIMIA BAHAN ALAM
SKS
: 2
DOSEN
: Dr. Syamsurizal, M.Si
WAKTU
: 22-29
Desember 2012
PETUNJUK : Ujian ini open book. Tapi tidak
diizinkan mencontek, bilamana ditemukan, maka anda dinyatakan GAGAL. Jawaban
anda diposting di bolg masing-masing.
1.
Jelaskan dalam jalur biosintesis triterpenoid, identifikasilah
faktor-faktor penting yang sangat menentukan dihasilkannya triterpenoid dalam
kuantitas yang banyak ?
Nama
Terpen diberikan terhadap senyawa yang mempunyai perumusan molekul C10H6,
secara etimologi berasal dari pohon terebinth (Pistacia terebinthus).
Triterpenoid : diturunkan dari
isoprenoid asiklik skualen (C30H50), komponen utuh dari minyak ikan, minyak
vegetable, jamur.
Berbagai triterpenoid organisme
merupakan prekursor langsung hidrokarbon dalam fosil sedimen dan minyak bumi.
Secara umum biosintesis terpenoid
terjadinya melalui 3 reaksi dasar :
1. Pembentukan isopren aktif berasal dari
asam asetat melalui asam mevalonat.
2. Penggabungan ekor dan kepala 2 unit
isoprene akan membentuk mono-, seskui-, di-, dan poli-terpenoid.
3. Penggabungan ekor dan ekor dari unit C15 atau C20 menghasilkan triterpenoid dan steroid.
3. Penggabungan ekor dan ekor dari unit C15 atau C20 menghasilkan triterpenoid dan steroid.
Dua bentuk isopren aktif yaitu
isopentenil pirofosfat (IPP) dan dimetilalil pirofosfat (DMAPP) harus ada dalam
biosintesis terpen dalam organisme. IPP dan DMAPP berasal dari asam mevalonat
Mekanisme pembentukannya melalui jalur
asam mevalonat :
As. Asetat teraktifasi oleh koenzim-A
membentuk asetil koenzim-A, selanjutnya melakukan kondensasi menghasilkan asam
asetoasetil koenzim-A. Asetoasetil koenzim-A mengalami kondensasi lagi dengan
asetil koenzim-A menghasilkan senyawa mevalonil koenzim-A selanjutnya mengalami
reduksi menjadi asam mevalonat. Reaksi selanjutnya adalah fosforilasi,
eliminasi asam fosfat dan dekarboksilasi menghasilkan IPP yg berisomerisasi
menjadi DMAPP oleh enzim isomerase IPP dan DMAPP sebagai unit isopren aktif
berkondensasi melalui interaksi kepala ke ekor yang merupakan polimerisasi
isopren untuk menghasilkan terpenoid. Biogenetik terpenoid berasal dari
isopentenyl-pyrophosphate (IPP) terdiri dari lima atom karbon sebagai batu bata
(building block) via jalur asam mevalonat (MVA). Isomer IPP adalah DMAPP
(dimethyl allyl pyrophosphate). Kedua molekul tsb bergabung menjadi
geranyl-pyrophosphate (GPP), farnesylpyrophosphate (FPP), dan geranylgeranyl
pyrophosphate (GGPP).
9Selanjutnya berturut-turut menjadi
monoterpena (10 C), seskuiterpena (15 C), dan diterpena (20 C).
Gambar 1. Pembentukan isoprene aktif
(IPP & DMAPP)
Gambar
2. Pembentukan Triterpenoid
Dari
jalur biosintesis tersebut kita bisa mengindentifikasi faktor-faktor penting
yang sangat menentukan dihasilkannya triterpenoid dalam kuantitas yang banyak,
antara lain :
a.
Senyawa Asam Asetat
Senyawa asam asetat yang berguna
untuk pembentukan asetil koenzim-A.
b.
Pembentukan asetil koenzim-A
c.
Pembentukan asam mevalonat
d.Pembentukan
dua isoprene aktif (yaitu isopentenil pirofosfat (IPP) dan
dimetilalil pirofosfat (DMAPP) )
As.
Asetat teraktifasi oleh koenzim-A membentuk asetil koenzim-A, selanjutnya
melakukan kondensasi menghasilkan asam asetoasetil koenzim-A. Asetoasetil
koenzim-A mengalami kondensasi lagi dengan asetil koenzim-A menghasilkan
senyawa mevalonil koenzim-A selanjutnya mengalami reduksi menjadi asam
mevalonat yang akhirnya membentuk IPP menjadi DMAPP. (Lihat gb.1)
e. Penambahan enzim pada pembentukan
triterpenoid
Dari
IPP menjadi DMPP lalu menjadi GPP dengan penambahan IPP, GPP menjadi FPP dengan
penambahan IPP, FPP akan menjadi squalene dengan penambahan FPP yang
selanjutnya rantai alifatik squalene disikliksasi menjadi squalene yang lebih
stabil, dengan penambahan oksigen menjadi 2,3 oxido squalene yang menjadi cikal
bakal saponin (senyawa triterpenoid). (Lihat gb. 2)
2.
Jelaskan dalam penentuan struktur
flavonoid, kekhasan signal dan intensitas serapan dengan menggunakan spektrum
IR dan NMR. Berikan dengan contoh sekurang-kurangnya dua struktur yang berbeda
?
Spektroskopi
adalah ilmu yang mempelajari interaksi antara gelombang elektromagnetik dengan
benda (Harmita, 2006). Metode spektroskopi berdasarkan pada penyerapan selektif
dari radiasi elektromagnetik molekul organik (Williams & Fleming, 2002).
1.
Spektroskopi Inframerah
Atom-atom
di dalam suatu molekul tidak diam melainkan bervibrasi. Bila radiasi dilewatkan
melalui suatu cuplikan, maka molekul-molekulnya dapat menyerap energi.
Penyerapan energi pada berbagai frekuensi dapat dideteksi oleh spektrofotometer
inframerah, yang memplot jumlah radiasi inframerah yang diteruskan melalui
cuplikan sebagai fungsi frekuensi radiasi (Hendayana, 1994). Spektrofotometer
inframerah merupakan salah satu metode analisis untuk mengetahui gugus fungsi
apa saja yang terdapat dalam suatu molekul organik (Harmita, 2006).
untuk penentuan senyawa organiknya,
dapat dilakukan :
a. Spectrum IR, untuk menentukan serta mengidentifikasi gugus
fungsi yang terdapat pada senyawa flavonoid, yang mana gugus fungsi dari
senyawa akan dapat ditentukan berdasarkan ikatan dari tiap atom.
b. Spectrum NMR, untuk mengetahui posisi atom-atom karbon yang
mempunyai proton atau tanpa proton.
a. Isolasi Flavonoid Pada Daun Katu
3.
Dalam isolasi alkaloid, pada tahap awal
dibutuhkan kondisi asam atau basa. Jelaskan dasar penggunaan reagen tersebut, dan
berikan contohnya sekurang-kurangnya tiga macam alkaloid ?
Alkaloid adalah suatu
golongan senyawa organik yang terbanyak ditemukan di alam. Hampir seluruh
senyawa alkaloda berasal dari tumbuh-tumbuhan dan tersebar luar dalam berbagai
jenis tumbuhan. Semua jenis alkaloida mengandung paling sedikit satu atom
nitrogen yang biasanya bersifat basa dan dalam sebagian besar atom nitrogen ini
merupakan bagian dari cincin heterosiklik. Hampir semua alkaloida yang
ditemukan di alam mempunyai keaktifan biologis tertentu, ada yang sangat
beracun tapi ada pula yang sangat berguna dalam pengobatan. Misalnya kuinin,
morfin, dan stiknin adalah alkaloida yang terkenal dan mempunyai efek
sifiologis dan psikologis. Alkaloida dapat ditemukan seperti biji, daun,
ranting dan kulit batang. Alkaloida umumnya ditemukan dalam kadar yang kecil
dan harus dipisahkan dari campuran senyawa yang rumit yang berasal dari
jaringan tumbuhan.
1.
Sifat-Sifat
Fisika
Umumnya
mempunyai 1 atom N meskipun ada beberapa yang memiliki lebih dari 1 atom N
seperti pada Ergotamin yang memiliki 5 atom N. Atom N ini dapat berupa amin
primer, sekunder maupun tertier yang semuanya bersifat basa (tingkat
kebasaannya tergantung dari struktur molekul dan gugus fungsionalnya).
Kebanyakan alkaloid yang telah diisolasi berupa padatan kristal tidak larut
dengan titik lebur yang tertentu atau mempunyai kisaran dekomposisi. Sedikit
alkaloid yang berbentuk amorf dan beberapa seperti; nikotin dan koniin berupa
cairan.
Kebanyakan
alkaloid tidak berwarna, tetapi beberapa senyawa yang kompleks, species
aromatik berwarna (contoh berberin berwarna kuning dan betanin berwarna merah).
Pada umumnya, basa bebas alkaloid hanya larut dalam pelarut organik, meskipun
beberapa pseudoalkalod dan protoalkaloid larut dalam air. Garam alkaloid dan
alkaloid quartener sangat larut dalam air.
2.
Sifat-Sifat
Kimia
Kebanyakan
alkaloid bersifat basa. Sifat tersebut tergantung pada adanya pasangan elektron
pada nitrogen.Jika gugus fungsional yang berdekatan dengan nitrogen bersifat
melepaskan elektron, sebagai contoh; gugus alkil, maka ketersediaan elektron
pada nitrogen naik dan senyawa lebih bersifat basa. Hingga trietilamin lebih
basa daripada dietilamin dan senyawa dietilamin lebih basa daripada etilamin.
Sebaliknya, bila gugus fungsional yang berdekatan bersifat menarik elektron
(contoh; gugus karbonil), maka ketersediaan pasangan elektron berkurang dan
pengaruh yang ditimbulkan alkaloid dapat bersifat netral atau bahkan sedikit
asam. Contoh ; senyawa yang mengandung gugus amida.
Kebasaan alkaloid menyebabkan
senyawa tersebut sangat mudah mengalami dekomposisi, terutama oleh panas dan
sinar dengan adanya oksigen. Hasil dari reaksi ini sering berupa N-oksida.
Dekomposisi alkaloid selama atau setelah isolasi dapat menimbulkan berbagai
persoalan jika penyimpanan berlangsung dalam waktu yang lama. Pembentukan garam
dengan senyawa organik (tartarat, sitrat) atau anorganik (asam hidroklorida
atau sulfat) sering mencegah dekomposisi. Itulah sebabnya dalam perdagangan
alkaloid lazim berada dalam bentuk garamnya. Reagensia pada alkaloid yaitu
pereaksi Meyer, pereaksi Wagner dan pereaksi Dragendorf. Beberapa pereaksi
pengendapan digunakan untuk memisahlkan jenis alkaloid. Pereaksi sering
didasarkan pada kesanggupan alkaloid untuk bergabung dengan logam yang memiliki
berat atom tinggi seperti merkuri, bismuth, tungsen, atau jood. Pereaksi mayer
mengandung kalium jodida dan merkuri klorida dan pereaksi Dragendorff
mengandung bismut nitrat dan merkuri klorida dalam nitrit berair. Pereaksi
Bouchardat mirip dengan pereaksi Wagner dan mengandung kalium jodida dan jood.
Pereaksi asam silikotungstat menandung kompleks silikon dioksida dan tungsten
trioksida. Berbagai pereaksi tersebut menunjukkan perbedaan yang besar dalam
halsensitivitas terhadap gugus alkaloid yang berbeda. Ditilik dari
popularitasnya, formulasi mayer kurang sensitif dibandingkan pereaksi wagner
atau dragendorff.
Kromatografi dengan penyerap yang cocok merupakan metode
yang lazim untuk memisahkan alkaloid murni dan campuran yang kotor. Seperti halnya
pemisahan dengan kolom terhadap bahan alam selalu dipantau dengan kromatografi
lapis tipis. Untuk mendeteksi alkaloid secara kromatografi digunakan sejumlah
pereaksi. Pereaksi yang sangat umum adalah pereaksi Dragendorff, yang akan
memberikan noda berwarna jingga untuk senyawa alkaloid. Namun demikian perlu
diperhatikan bahwa beberapa sistem tak jenuh, terutama koumarin dan α-piron,
dapat juga memberikan noda yang berwarna jingga dengan pereaksi tersebut.
Pereaksi umum lain tetapi kurang digunakan adalah asam fosfomolibdat,
jodoplatinat, uap jood, dan antimon (III) klorida.
Kebanyakan alkaloid bereaksi dengan pereaksi-pereaksi
tersebut tanpa membedakan kelompok alkaloid. Sejumlah pereaksi khusus tersedia
untuk menentukan atau mendeteksi jenis alkaloid khusus. Pereaksi Ehrlich
(p-dimetilaminobenzaldehide yang diasamkan) memberikan warna yang sangat
karakteristik biru atau abu-abu hijau dengan alkaloid ergot. Perteaksi serium
amonium sulfat (CAS) berasam (asam sulfat atau fosfat) memberikan warna yang berbeda
dengan berbagai alkaloid indol. Warna tergantung pada kromofor ultraungu
alkaloid.
Campuran feriklorida dan asam perklorat digunakan untuk
mendeteksi alkloid Rauvolfia. Alkaloid Cinchona memberikan warna
jelas biru fluoresen pada sinar ultra ungu (UV) setelah direaksikan dengan asam
format dan fenilalkilamin dapat terlihat dengan ninhidrin. Glikosida steroidal
sering dideteksi dengan penyemprotan vanilin-asam fosfat.
Pereaksi Oberlin-Zeisel, larutan feri klorida 1-5% dalam
asam klorida 0,5 N, sensitif terutama pada inti tripolon alkaloid kolkisin dan
sejumlah kecil 1 μg dapat terdeteksi.
a. Pembuatan Pereaksi Mayer
Bahan : a.
HgCl2 1,358 gr, dilarutkan dalam 60 ml aquadest
b.
KI 5 gr, dilarutkan dalam 20 ml aquadest
Dicampurkan larutan a dan b kemudian
ditambahkan 100 ml aquadest.
b. Pembuatan Pereaksi Wagner
larutan dibuat dengan campuran iodine
dan kalium iodide.
c. Pembuatan Pereaksi Dragendorf
Bismut nitrat dilarutkan dalam HCl.
Contoh beberapa isolasi senyawa alkaloid
pada tumbuhan :
1.
Isolasi kafein dari daun teh
Untuk
mengisolasi kafein dari daun teh kering , 25 gram daun teh kering ditambahkan 20 gram Na2CO3
dan ditambahkan 275 ml air mendidih. Na2CO3 merupakan garam non-polar, yang
dapat terurai didalam air menjadi ion Na+ yang mengikat kafein dan CO3- yang
mengikat H2O membentuk HCO3 (sutau asam). Garam kafein + Na larut dalam air.
Air mendidih yang ditambahkan berfungsi membuka pori-pori dari daun the agar
ekstrak daun teh dapat keluar dengan sempurna dan kafein yang didapatkan cukup
banyak. Larutan bersifat basa karena panambahan Na2CO3
yang bresifat basa. Larutan dimasukkan kedalam corong pisah dan ditambahkan 30
ml diklorometan, dikocok kemudian didiamkan , panambahan dikloromaetan
berfungsi mengikat kafein yang tadinya berbentuk garam dengan Na+ menjadi
berikatan dengan diklorometan, sebab kepolaran kafein hampir sama dengan
diklorometan tersebut sehingga kelarutan kafein cukup besar didalam
diklorometan (140 mg/l) sementara kelarutan kafein didalam air lebih rendah (22
mg/l). Adanya perbedaan kelarutan, maka terbentuk dua lapisan pada corong
pisah, lapisan atas adalah lapisan air dan lapisan bawah adalah larutan
diklorometan-kafein.
Penambahan
MgSO4 anhidrat, anhidrat sendiri berarti tanpa air sehingga fungsi
MgSO4 anhidrat ini adalah untuk mengikat air yang masih terbawa
dalam larutan diklorometan kaefin, setalah itu didestilasi diatas penangas air.
Destilasi ini berfungsi untuk menghilangkan diklorometan (titih didih 80 0C)
dan meninggalkan residu kristal berwarna putih kekuningan , dimana kristal
tersebut merupakan kafein yang masih kotor. Lalu kedalam kristal ditambahkan
aseton panas, aseton ini berfungsi melarutkan kafein dan pengotor yang masih
tertinggal, kemudian ditambahkan n-heksana untuk mengikat aseton dan pengotor. Aseton
panas merupakan pelarut yang bersifat semi polar namun lebih cenderung ke
polar, sehingga aseton dapat berikatan dengan baik dengan n-heksana.
Pengkristalan kafein terjadi karena hanya kafein yang bersifat nonpolar dalam
campuran tersebut, kristal disaring dengan corong Buchner yang dilapisi dengan
kertas saring lalu dipanaskan. Pemanasan pada kristal murni dimaksudkan untuk
mendapatkan kristal murni yang kering.
Selanjutnya,
pengujian alkaloid untuk kristal yang diperoleh, diambil 10 mg kristal lalu
dilarutkan dengan sedikit air kemudian ditambahkan 1-2 tetes pereaksi
dragendorf dan menghasilkan larutan berwarna jingga yang menunjukkan adanya
alkaloid.
2.
Isolasi Nikotin pada daun tembakau
Nikotin
merupakan senyawa alkaloid yang terdapat dalam tanaman tembakau dan berpotensi
sebagai insektisida alami pengganti insektisida sintetik. Nikotin mempunyai
sifat mudah terurai oleh faktor alam sehingga tidak meninggalkan residu pada
tanaman inang. Isolasi nikotin dapat dilakukan dengan teknik maserasi dan dilanjutkan
dengan ekstraksi menggunakan pelarut kloroform. Teknik isolasi ini cukup mudah
dan dapat menghasilkan isolat yang mengandung nikotin dalam konsentrasi cukup
besar dan relatif murni.
Dalam
penelitian ini dilakukan isolasi nikotin dari daun tembakau kering dengan cara
soxhletasi menggunakan pelarut metanol kemudian dilakukan penggaraman dengan
asam dan ekstraksi alkaloid dengan basa. Ekstrak yang diperoleh kemudian
dimurnikan dengan KLT, dan kromatografi kolom. Setelah itu dianalisis
menggunakan IR, UV, dan GC-MS. Ekstrak tembakau yang lain diuji efektivitasnya
sebagai insektisida penggerek batang padi dengan cara disemprotkan ke
persemaian padi dengan konsentrasi yang bervariasi.
Dari
hasil analisis KLT menggunakan larutan pengembang metanol didapatkan harga Rf =
0,725. Hasil analisis spektra IR menunjukkan adanya gugus amina tersier
aromatis, gugus metil, gugus amina tersier alifatis, dan ikatan C-H aromatis.
Hasil kromatogram GC-MS menunjukkan senyawa nikotin muncul pada puncak dengan
waktu retensi = 9,245 s dan indeks kemiripan 63 %, hal ini menunjukkan bahwa
dalam daun tembakau terdapat alkaloid nikotin. Hasil dari spektrofotometer UV
menghasilkan panjang gelombang maksimum 206 nm yang menunjukkan adanya
kearomatisan dari cincin piridin dalam nikotin. Ekstrak tembakau yang lain
digunakan untuk uji efektivitas terhadap hama penggerek batang padi, dengan
cara disemprotkan tanaman padi yang di dalamnya terdapat penggerek batang padi,
didapatkan Fhitung = 19.061 dan Ftabel = 3.48. Karena Ftabel < Fhitung maka
Ho ditolak dan Ha diterima, yaitu konsentrasi ekstrak daun tembakau
mempengaruhi efektivitasnya sebagai insektisida penggerek batang padi.
3.
Isolasi Karfain pada daun papaya
CARA ISOLASI
a. Bahan yang dibuat serbuk diekstraksi
dengan air atau alkohol cair yang mengandung dilute acid. Pigmen dan bahan
–bahan lain yang tidak diinginkan terpisah karena penggojogan dengan kloroform
atau pelarut organic lain. Alkaloid bebas kemudian diendapkan dengan penambahan
sejumlah sodium bikarbonat atau ammonia dan dipisahkan dengan filtrasi atau
ekstraksi dengan pelarut organic. (Trease and Evans,1989)
b. Daun Carica papaya tua diekstraksi
dengan cara maserasi dengan pelarut etanol-air (1:3). Maserasi dilakukan selama
3 hari terlindung dari cahaya matahari sambil seringkali diaduk agar kondisi
kesetimbangan segara dicapai,diasumsikan bahwa selama 3 hari senyawa kimia
dalam bahan sudah tersari dengan sempurna.( Muhammad Yanuar,2005)
4.
Jelaskan keterkaitan diantara
biosintesis, metode isolasi dan penentuan struktur senyawa bahan alam . Berikan
contohnya.
Senyawa bahan alam merupakan senyawa
metaboit sekunder. Senyawa ini seringkali masih terikat dalam bentuk
bersama-sama dengan senyawa metanoit primer seperti lemak, karbohidrat, asam
amino, protein dll. Untuk itu harus digunakan tekhnik pemisahan untuk
memisahkan senyawa bahan alam tersebut.
Biosintesis
merupakan proses pembentukan senyawa-senyawa baru dengan bantuan enzim, zat pereaksinya dan jalur yang terlibat
dalam proses tersebut hingga menghasilkan bentuk struktur senyawa yang kita
inginkan.
Metode isolasi merupakan cara
pemisahan suatu senyawa dari sampel yang akan diisolasi, pada isolasi kita
harus memperhatikan pelarut yang akan digunakan dan sifat sampel yang akan
diisolasi, tekhnik pemisahan dan kondisi lingkungan saat pemisahan terjadi.
Sedangkan penentuan struktur
senyawa bahan alam merupakan cara untuk
mengidentifikasi suatu struktur dalam senyawa, dapat dilakukan dengan menggunakan hasil isolasi / isolate dari pemisahan yang sudah
dilakukan, yaitu dengan penentuan spektroskopi (IR, NMR, UV ) dan kromatografi.
Jadi, hubungan
keterkaitannya..mula-mula kita indentifikasi struktur senyawa yang akan kita
pisahkan, apa gugus fungsi yang berperan aktif disitu, bersifat apakah
senyawanya, asam atau basakah, bagaimana sifat kimia dan fisik dari senyawa
tersebut. Setelah kita tau baru kita indentifikasi lagi jalur biosintesisnya,
apa peran enzim, jalur apa yang digunakan, bagaimana gugus fungsi reaktan dan
bagaimana gugus fungsi setelah menjadi produk. Setelah kita tahu baru kita
isolasi dari tumbuhan tertentu, pada isolasi ini kita harus memilih tekhnik
pemisahan yang sesuai (apakah pakai cara maserasi, destilasi, atau KLT dsbg),
bagaimana sifat pelarutnya asam atau basa, volatile atau tidak, polar atau non
polar, apa perubahan untuk penanda positif adanya senyawa tersebut dalam
simplisia (entah itu bercak noda atau endapan atau Kristal amorf dll)
Misal Pemisahan Senyawa Alkaloid
Kafein Pada Daun Teh
Kafein dalam
tanaman disintesis dari xanthosin melalui 3 tahap N-metilasi, dimana tahap
metilasi ini dibantu oleh aktivitas enzim yaitu enzim metal transferase.
Untuk
mengisolasi kafein dari daun the kering , 25 gram daun teh kering ditambahkan 20 gram Na2CO3
dan ditambahkan 275 ml air mendidih. Na2CO3 merupakan garam non-polar, yang
dapat terurai didalam air menjadi ion Na+ yang mengikat kafein dan CO3- yang
mengikat H2O membentuk HCO3 (sutau asam). Garam kafein + Na larut dalam air.
Air mendidih yang ditambahkan berfungsi membuka pori-pori dari daun the agar
ekstrak daun the dapat keluar dengan sempurna dan kafein yang didapatkan cukup
banyak. Larutan bersifat basa karena panambahan Na2CO3
yang bresifat basa. Larutan dimasukkan kedalam corong pisah dan ditambahkan 30
ml diklorometan, dikocok kemudian didiamkan , panambahan dikloromaetan
berfungsi mengikat kafein yang tadinya berbentuk garam dengan Na+ menjadi
berikatan dengan diklorometan, sebab kepolaran kafein hampir sama dengan
diklorometan tersebut sehingga kelarutan kafein cukup besar didalam
diklorometan (140 mg/l) sementara kelarutan kafein didalam air lebih rendah (22
mg/l). Adanya perbedaan kelarutan, maka terbentuk dua lapisan pada corong
pisah, lapisan atas adalah lapisan air dan lapisan bawah adalah larutan
diklorometan-kafein.
Penambahan
MgSO4 anhidrat, anhidrat sendiri berarti tanpa air sehingga fungsi
MgSO4 anhidrat ini adalah untuk mengikat air yang masih terbawa
dalam larutan diklorometan kaefin, setalah itu didestilasi diatas penangas air.
Destilasi ini berfungsi untuk menghilangkan diklorometan (titih didih 80 0C)
dan meninggalkan residu kristal berwarna putih kekuningan , dimana kristal
tersebut merupakan kafein yang masih kotor. Lalu kedalam kristal ditambahkan
aseton panas, aseton ini berfungsi melarutkan kafein dan pengotor yang masih
tertinggal, kemudian ditambahkan n-heksana untuk mengikat aseton dan pengotor.
Aseton panas merupakan pelarut yang bersifat semi polar namun lebih cenderung
ke polar, sehingga aseton dapat berikatan dengan baik dengan n-heksana.
Pengkristalan kafein terjadi karena hanya kafein yang bersifat nonpolar dalam
campuran tersebut, kristal disaring dengan corong Buchner yang dilapisi dengan
kertas saring lalu dipanaskan. Pemanasan pada kristal murni dimaksudkan untuk
mendapatkan kristal murni yang kering.
Selanjutnya,
pengujian alkaloid untuk kristal yang diperoleh, diambil 10 mg kristal lalu
dilarutkan dengan sedikit air kemudian ditambahkan 1-2 tetes pereaksi
dragendorf dan menghasilkan larutan berwarna jingga yang menunjukkan adanya
alkaloid.
Penentuan
struktur, kekhasan signal dan intensitas serapan hasil isolasi dapat
diidentifikasi dengan spektroskopi (UVR, NMR, & IR).
